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Western Blot 常見(jiàn)問(wèn)題分析(一)

發(fā)布時(shí)間:2019/7/16 6:31:05      閱讀次數(shù):1951

Western Blot,通常我們?cè)谌粘=涣髦姓f(shuō)的就是簡(jiǎn)稱“WB”,中文名稱是“蛋白印跡”或“免疫印跡”,其核心本質(zhì)是抗原抗體的特異性反應(yīng)。Western Blot的基本原理是蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠電泳后,按分子量大小順序在分離膠中分離開(kāi)來(lái),通過(guò)轉(zhuǎn)膜可將膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體(通常是PVDF膜、NC膜和尼龍膜)表面,然后加入一抗去特異性結(jié)合膜上蛋白質(zhì),再加入酶或者熒光素標(biāo)記的二抗,二抗與一抗結(jié)合反應(yīng)后,通過(guò)底物顯色、化學(xué)發(fā)光等方法檢測(cè)目的蛋白。Western Blot實(shí)驗(yàn)一般用來(lái)判斷特定蛋白在樣本中是否表達(dá)及粗略分析特定蛋白表達(dá)量的高低。



Western Blot是實(shí)驗(yàn)室中常見(jiàn)且重要的一種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法,一次完整的實(shí)驗(yàn)一般需要兩天時(shí)間,當(dāng)我們對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果滿懷期待or充滿信心,也許現(xiàn)實(shí)會(huì)給我們一記響亮的耳光。
 



下面,小科整理了一些Western Blot 結(jié)果常見(jiàn)問(wèn)題:


/   條 帶 弱   / 

 


原因分析1:抗原量不足;

解決方案1:上樣前做蛋白定量,增大上樣量;

蛋白定量的意義:保證各處理組總蛋白上樣量一致,蛋白總量不足可能妨礙對(duì)目的蛋白的鑒定,蛋白含量太高會(huì)使條帶扭曲,影響電泳的分辨力;


原因分析2:蛋白質(zhì)儲(chǔ)存過(guò)程中降解;

解決方案2:重新制備樣品;


原因分析3:膜錯(cuò)誤選擇,轉(zhuǎn)膜不完全;

解決方案3:選擇合適的轉(zhuǎn)印膜:大蛋白(>20KDa)選大孔膜(0.45μm),小蛋白(<20KDa)選小孔膜(0.2μm);優(yōu)化轉(zhuǎn)膜條件、時(shí)間、電壓。

轉(zhuǎn)膜中的要點(diǎn)和建議

轉(zhuǎn)膜具體情況 要點(diǎn)和建議
  大分子量蛋白   1)大的蛋白傾向于在膠里沉淀,阻礙轉(zhuǎn)移。在轉(zhuǎn)膜緩沖液里加入0.1%的SDS有助于解除上述現(xiàn)象;
  2)甲醇傾向于從蛋白上移除SDS,因此把甲醇濃度降到10%甚至更少,有助于減少上述沉淀現(xiàn)象,
  適用于大分子量蛋白轉(zhuǎn)膜;
  3)用4℃濕轉(zhuǎn)過(guò)夜代替半干法轉(zhuǎn)膜。
  小分子量蛋白   1)SDS阻礙蛋白和膜的結(jié)合,但小分子量蛋白受到的影響更大。若轉(zhuǎn)膜的蛋白很小,可以考慮去掉
  緩沖液里的SDS;
  2)保持甲醇濃度在20%;
  3)對(duì)于非常小的蛋白,不要用半干法。
  膜的方向確定   轉(zhuǎn)移后剪角做標(biāo)記,分清正反面;用鉛筆做記號(hào)或電泳時(shí)Marker上成非對(duì)稱的。
  轉(zhuǎn)膜后背景高   選擇NC膜;另外,雞的抗體傾向于和PVDF膜及一些尼龍膜結(jié)合而導(dǎo)致高背景;可以換成NC膜以減
  少背景。
  轉(zhuǎn)膜時(shí)污染   避免手指觸碰膜,可以用鑷子來(lái)取膜。手指上的油脂和蛋白質(zhì)會(huì)阻礙有效的轉(zhuǎn)膜,也會(huì)弄臟雜交。
  濾紙的大小   確保濾紙和膜的大小與膠一致。當(dāng)使用半干法轉(zhuǎn)膜時(shí),過(guò)多的部分會(huì)阻礙電流穿過(guò)膜。

原因分析4:抗體量不足;

解決方案4:增加抗體濃度,注意抗體儲(chǔ)存條件(避免反復(fù)凍融);

抗體的保存和使用:

1 收到抗體后按要求離心后再打開(kāi)管蓋進(jìn)行分裝盒保存;

2 對(duì)于大部分抗體,比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃

    2.1 分裝的量以一次實(shí)驗(yàn)用為好,最好不能少于10ul每份,因?yàn)榉盅b體積越小,抗體的濃度越可能受到蒸發(fā)及管壁吸附的影響;

    2.2 復(fù)融后的分裝抗體如果一次用不完,將剩余母液保存在4℃,避免再凍起來(lái);

3 大部分抗體收到后4℃短暫保存1-2周對(duì)抗體活性是沒(méi)有影響的。

任何時(shí)候,絕對(duì)避免反復(fù)凍融。


原因分析5:抗體孵育時(shí)間不足;

解決方案5:建議一抗4度孵育過(guò)夜;相對(duì)于2小時(shí)孵育,一抗4度過(guò)夜孵育會(huì)顯著增加抗體的結(jié)合。


/   條 帶 彎 曲  /   
 

原因分析1:條帶向上彎曲(︶ 條帶呈笑臉狀):凝膠制備不均勻,中間冷卻不好;
解決方案1:
分離膠配好后用水壓線,保證水平,配膠緩沖液現(xiàn)用現(xiàn)配,混合均勻后制膠。

原因分析2:條帶向下彎曲(︵ 條帶呈皺眉狀):可能是由于裝置不合適,特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡;
解決方案2:制膠架裝配好后,用水檢查是否有空隙再灌膠。
原因分析3:條帶顯示不均勻,中空:可能凝固太快導(dǎo)致聚合不均勻;
解決方案3:使用合適的促凝劑,制膠液混合好后及時(shí)灌膠


/   彌 散  /   

原因分析1:加樣過(guò)量;
解決方案1:降低上樣量,推薦每孔上樣20-30ug。
 

原因分析4:電極不平衡,加樣位置偏斜;
解決方案4:電泳槽水平放置,配膠時(shí)盡量小心,確保每個(gè)加樣孔完好無(wú)損。
原因分析2:蛋白降解;
解決方案2:使用蛋白酶抑制劑。
 
原因分析3: 樣品溶解不好;
解決方案3:樣品制備中一定要充分勻漿并超聲裂解。
 

原因分析5:樣品中含有不可溶顆粒;
解決方案5:緩沖液配好后過(guò)濾除菌,樣品裂解保證可溶性

更多實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題留待下次討論,敬請(qǐng)期待。

 

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